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实时荧光定量PCR实验的5个重要技巧
无论是qPCR实验的新手，还是经验丰富的专家，均有进一步提升技能的空间，从而获取完善的qPCR结果。参考以下5个技巧，提升qPCR技能：
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1.设计出色的引物和探针
确定参考基因；匹配的引物可能已经存在
目标扩增子大小：70–150 bp
跨外显子连接
GC含量：40–60%
温度：50–65°C
限制连续的重复核酸数目
使用引物BLAST验证特异性
使用IDT的OligoAnalyzerTM等在线工具，确保二级结构最小化并防止引物二聚体的形成
在qPCR设备上运行温度梯度优化Ta
使用IDT的PrimerQuest®等在线工具设计特定的引物/探针组合
将寡聚物（100μM）及其稀释的等分试样（10-20μM）在-20°C的无核酸酶水中储存。
2.分离高质量的RNA
RNA极易降解；须使用个人防护装备，确保所有工具及工作区域都用H2O2消毒，并将样品置于冰上
在进行cDNA合成之前，确保RNA的质量（260/280比例为1.8–2.0；理想情况下为2.0）及数量（视不同情况而定）
如果担心质量，可进行RNA凝胶电泳；若发生拖尾，而非两条干净的条带（2:1），则表明质量较差
在cDNA合成之前，用DNA酶处理以去除基因组DNA（gDNA）中的污染。
3.模板量及反应效率细化
使用前对所有试剂进行快速涡旋混匀，必要时应使用低容量（如P10）移液管
连续稀释模板cDNA，以确定产生20-30理想循环阈值（Ct值）所对应的稀释度
根据所有引物对的标准曲线验证反应效率：[10（-1/斜率）-1]*100%，R2>0.95；始终使用新鲜稀释液
多重分析验证
4.加入合适的对照品
无模板对照（NTC）可用于确定master mix中是否存在污染
阳性对照可确保反应条件得到满足，并有助于判断新引物/探针是否有效
无逆转录酶对照（RT）可确定是否有DNA污染（如来自gDNA）
对于基于SYBR®的测定，循环结束后的熔融曲线可用于判断是否仅一种产物被扩增
内部阳性对照可确定是否存在PCR反应抑制剂
5.选择合适的CT分析方法：阈值与回归
验证循环反应条件是否正确（尤其是使用共享设备时）
在许多qPCR设备上，默认是回归分析模式
对于阈值分析，应在丰度最高样品所对应的Ct值两个循环之前设置基线；阈值应设定在产品的指数增长阶段
