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问题：抑制不充分

反应效率低的一个常见原因是PCR抑制剂的存在。

如发现效率差且R2值<0.98，可能的原因是移液错误或标准曲线未新鲜制备。

解决方案

样品稀释过程中，可能会损失PCR抑制剂。

在生成标准曲线之前稀释模板，以找到引物对特有的理想Ct范围。

为熟练掌握移液技能，将每个样品制备成一式三份，如使用多通道移液管，则肉眼验证每个样品的绘制是否相同。

确保标准曲线/稀释物新鲜制备，因为储存的样品可随着时间的推移而蒸发。

问题：意外值

尤其在共享仪器上使用时，其他用户可能对现有操作规程进行了更改。

其他潜在原因包括：qPCR运行前样本标记错误或对孔的检测/选择不正确。

解决方案

运行前检查热循环条件，确保现有操作规程的正确性

验证是否选择了正确的染料、体积及检测孔的选择是否正确。

为每个使用仪器的实验室或组设置一个特定的账户，以存储所需的操作规程。

使用可存储多个操作规程的qPCR仪器。

Azure Cielo qPCR系统，具有3/6通道可供选择，可存储定制化的操作规程。

问题：复孔不一致

样本间的不一致可能是RNA降解或起始量太少所致

解决方案

在逆转录前，用分光光度计检测RNA浓度和质量，和/或在琼脂糖凝胶上检测RNA。

任何低于1.9–2.0理想260/280比值的情况，都可能表明存在PCR抑制剂。凝胶拖尾而非两条干净的（2:1）条带表明发生降解。

重新进行RNA分离

考虑使用其他更适合的方法，如二氧化硅纯化柱及苯酚-氯仿。

问题：Ct值出现过早

解决此问题需对现有引物对进行研究。

引物可能并非跨越外显子-外显子连接，或可能产生一种以上的产物。

转录本可能在样本中自然高表达。

如果样品已储存了一段时间，蒸发可能会导致浓度增加。

解决方案

通过确保引物跨越外显子-外显子连接，将基因组DNA污染的机会降至最低。

作为预防措施，最好在逆转录前对样品进行DNA酶处理。

为验证是否只有一种产物，对引物进行BLAST。

热循环结束后，运行熔解曲线，和/或对qPCR产物进行凝胶电泳。

如果转录物是自然高表达的，在所有样本中使用相同的稀释因子来稀释模板，产生理想的Ct范围。

为防止样品蒸发，确保管帽用石蜡膜密封，以便长期储存。

问题：无模板对照（NTC）阳性

将模板移液至已加有预混液的孔中时，模板有时会溅到相邻的（NTC）孔中。

其他原因还包括试剂污染或引物二聚体的形成

解决方案

使用70%的乙醇清洁工作区域和移液管，如有试剂溢出，则使用10%的漂白剂。

准备新的模板稀释液，在移液模板时须格外小心（防止飞溅）。

尽可能将NTC与板上的任何模板样品分离，必要时使用新试剂。

为检测引物二聚体的形成，在qPCR循环结束时添加解离曲线（熔融曲线），并检查是否存在其他峰值，通常在较低的T。