Azure Biosystems Inc

蛋白质样品上样至垂直凝胶电泳系统的凝胶中

Step 1: 凝胶电泳

Western Blot的第一步是使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离样品中的蛋白质。在SDS-PAGE中，蛋白质根据其分子量大小迁移，较小的蛋白质通过凝胶的迁移速率更快。聚丙烯酰胺的浓度决定了蛋白质在凝胶中移动的难易程度，更高浓度的凝胶，更适合分离小分子量的蛋白质。

可手工制备凝胶，也可选择商品化的不同浓度梯度的预制胶。

Azure Aqua四通道迷你电泳仪：垂直电泳分离系统，使用10 cm x 8 cm的胶，支持手工制胶。
Azure Aqua电源：可同时对4个不同电泳槽模块进行供电，可在该电源设备上创建、存储电泳或blot的实验规程。

Step 2：转膜

蛋白质分离完成后，从聚丙烯酰胺凝胶转移至固体膜载体上。膜通常分为NC膜和PVDF膜。转移首先需组装转移“三明治”（图1），其中凝胶贴着膜放置，随后放入转膜夹中，两侧各有滤纸和海绵，滤纸、海绵起承载转膜缓冲液，以及支撑作用。将三明治浸没于槽中的转移缓冲液中，电流通过“三明治“将蛋白质从凝胶转移至膜上。

试剂及耗材

转膜槽：可同时完成2块胶的转膜。Azure Aqua转膜仪具有转膜所需全套材料，同时配备2套转膜夹和冷却单元。转膜夹及电极均被颜色编码，确保插入方向正确，让转膜更方便。
Azure Aqua电源：可同时为4个不同模块供电。可在该电源设备上创建、存储电泳或blot的实验规程。
预切割膜的使用，可节约“转膜三明治”的制作时间，并减少浪费。有3种尺寸可供选择：9 cm x 7 cm，10 cm x 15 cm及13 cm x 18 cm。
预切割膜的两种类型：
- PVDF膜：3种尺寸可供选择，分别是9 cm x 7 cm，10 cm x 15 cm及13 cm x 18 cm。
- NC膜：尺寸为10 cm x 15 cm，具有两种孔径大小。
Azure转移缓冲液：独特配方，提高蛋白转膜效率及灵敏度。

图1.湿转法流程。将提前在转膜缓冲液中平衡好的凝胶与膜（NC膜或PVDF膜）相互贴置。将提前浸于转膜缓冲液中的滤纸及海绵置于“三明治”的外侧，转膜夹紧密夹住“三明治”，并被悬置于转膜槽中的缓冲液内。转膜夹上具有电极，使得电流可通过“三明治”，从而实现蛋白质从凝胶到膜的迁移。

Step 3:封闭

转印后需在封闭缓冲液中孵育膜，来阻断膜上的非特异性结合位点。封闭缓冲液包括脱脂奶粉或血清白蛋白等。

Azure无蛋白封闭缓冲液

Azure荧光封闭缓冲液

Azure化学发光封闭缓冲液

试剂及耗材

Azure无蛋白封闭缓冲液：配方优化的无蛋白封闭缓冲液，同时适用于荧光和化学发光Western Blot检测。某些实验中，一抗可与自制封闭缓冲液中的蛋白发生交叉反应。对于此类实验，这款封闭缓冲液是绝佳选择。
Azure化学发光封闭缓冲液：独特配方，可有效增强化学发光Western Blot的信号强度，降低背景。
Azure荧光封闭缓冲液：配套Azure荧光Western Blot成像设备（如Azure 500）使用。优化配方，有助于稳定荧光信号，降低背景噪音。

Step 4: 一抗孵育

将封闭的膜和一抗一起孵育。孵育条件取决于抗原-抗体结合效率。一抗可在封闭缓冲液中稀释。通过一系列的洗涤，洗去多余的未结合的一抗。

试剂及耗材

孵育托盘有盖子，可防止灰尘或其他污染物接触印迹。通常有透明或黑色两种，有各种尺寸，非常适合洗涤
洗涤缓冲液：兼容所有化学发光和荧光Western Blot。
荧光印迹洗涤缓冲液是近红外荧光Western Blot的最佳选择，优化的配方，使得对于所有荧光印迹，均具有高信噪比

黑色孵育盒尤其适用于光敏感的实验应用，如近红外荧光及化学发光Western blots或蛋白胶。

Step 5: 二抗孵育

使用荧光基团或辣根过氧化物酶（HRP）等酶标记的二抗孵育印迹膜，通过一系列的洗涤，洗去多余的未结合的二抗。二抗通过荧光团标记的，可使用数字成像直接激发检测；二抗通过辣根过氧化物酶（HRP）等酶标记的，与底物反应发光（化学发光）或生成有色产物，可使用数字成像系统或胶片法进行检测。

试剂及耗材

孵育托盘有盖子，可防止灰尘或其他污染物接触印迹。通常有透明或黑色两种，有各种尺寸，非常适合洗涤
洗涤缓冲液：兼容所有化学发光和荧光Western Blot
荧光印迹洗涤缓冲液是近红外荧光Western Blot的最佳选择，优化的配方，使得对于所有荧光印迹，均具有高信噪比。

成像检测

最后，检测结合的二抗。对于化学发光检测，将印迹与化学发光底物一同孵育，并使用Azure 300多功能分子成像系统进行成像检测，或在暗室中使用胶片检测发射的光。对于荧光检测，使用诸如Azure 500多功能分子成像系统对印迹进行成像，该成像系统具有激发荧光团的光源及检测发射荧光所需的滤光片。

Azure 500是一款多通道、多模式荧光成像系统，具有IR、可见光和UV激发通道。使用其近红外（NIR）模式，可更有效地对同一位置的两个不同目标进行成像和定量。在其绿色通道中，可进行荧光总蛋白或管家蛋白归一化，而无需剥离和重新探测Western Blot。

革新Western Blot体验。Azure多功能分子成像系统具有卓越性能，支持近红外NIR荧光、可见光、化学发光Western Blot。

试剂及耗材

化学发光HRP底物。Azure具有以下类型可供选择
- Radiance ECL：提供持久的信号和皮克级灵敏。
- Radiance Plus：为检测低丰度蛋白质提供低至飞克级的灵敏度。
- Radiance Q：皮克级检测灵敏度，宽广的线性动态范围，适用于CCD成像系统。
化学发光笔：使用注释笔，如Azure ChemWriter，可以在转移膜上书写或绘制，一旦加入化学发光底物，即可在标记上发出光信号。
印迹膜支撑架：透明塑料片，在成像过程中，用于承托化学发光印迹，是保鲜膜的无褶皱替代品。

Step 6: Western Blot结果分析

可使用AzureSpot Pro分析软件对成像结果进行分析。为获取Western Blot定量信息，可在总蛋白归一化（TPN）功能中，将目的蛋白信号与管家蛋白或总蛋白的信号进行比较。

试剂及耗材

AzureRed荧光总蛋白染色液是一种凝胶或印迹的总蛋白染色试剂，可用于TPN，可使用基于激光和CCD的成像系统进行检测，并与下游Western Blot或质谱法完全兼容。
TotalStain Q是一种可用于TPN的荧光总蛋白染色剂。具有适用于NC膜和PVDF膜的不同版本。
AzureSpot Pro这类分析软件，有助于进行稳定的Western Blot分析，同时具有背景扣除、条带检测及归一化分析等功能。

AzureSpot Pro让印迹分析更方便，具有背景扣除、条带检测及归一化分析等功能。